MVA-Ag85B-TB10.4和MVA-tPA-Ag85B-TB10.4结核疫苗的构建及免疫原性研究

【摘要】结核病作为一种人类疾病大约出现在70000年前的非洲，而其病原体结核分枝杆菌也被发现超过一个世纪。但如今，结核病仍然是困扰人类的一个重大疾病。据世界卫生组织统计，2012年，全世界新增860万结核病患者，并有130万人因结核病而死亡。目前唯一被广泛应用的结核杆菌疫苗卡介苗，对于成人的保护效果并不好，所以新型有效结核疫苗的研发迫在眉睫。结核杆菌有众多的分泌蛋白，其中一些已被证明具有良好的免疫原性，并在一些疫苗中得到了应用。Ag85B蛋白即为一种被众多新型结核疫苗采用的抗原蛋白，是Fbp蛋白家族中的一员，能够帮助分枝杆菌粘附到粘膜表面，从而促进其进入宿主细胞。TB10.4是ESAT‐6家族中的一员，其是分枝杆菌铁、锌离子的摄入通道，为结核分枝杆菌的生长所必需。病毒载体在目前的疫苗研究中也越来越被重视，其中痘病毒载体由于其良好的免疫原性和优秀的安全性，被认为是很好的候选疫苗载体。本研究中，应用痘病毒载体MVA构建了表达Ag85B‐TB10.4融合蛋白的重组结核疫苗MVA‐Ag85B‐TB10.4。并为了提高蛋白的表达量，通过在Ag85B‐TB10.4的N端引入组织纤溶酶原激活因子前导信号肽tPA，构建了MVA‐tPA‐Ag85B‐TB10.4，以期产生更好的免疫效果。具体的研究内容如下：第一，通过PCR得到Ag85B‐TB10.4和含有tPA信号肽、HA标签的Ag85B‐TB10.4基因，将其连接到pcDNA3.1(‐)表达载体上，将质粒转染入293T细胞中，检测表达量。WesternBlot检测结果表明，Ag85B‐TB10.4基因在细胞内能够正常表达，同时tPA信号肽对蛋白表达量的提高有明显作用。第二，将Ag85B‐TB10.4基因和tPA‐Ag85B‐TB10.4基因通过穿梭质粒pSC11M1重组到MVA中，筛选得到MVA‐Ag85B‐TB10.4和MVA‐tPA‐Ag85B‐TB10.4两个病毒株。通过对感染的BHK‐TK‐细胞进行WesternBlot检测，证明重组病毒株能够正常表达外源蛋白。第三，将两株病毒扩增纯化，检测滴度后，免疫Balb/c小鼠，另免疫MVA‐Blank和PBS作为对照组。两次免疫后检测细胞免疫应答效果。结果显示，抗原蛋白和肽刺激后，MVA‐Ag85B‐TB10.4诱导产生了较弱的IFN‐γ分泌，而MVA‐tPA‐Ag85B‐TB10.4无论在全蛋白刺激下，还是各种表位肽刺激下产生的IFN‐γ都要远远高于MVA‐Ag85B‐TB10.4，证明tPA信号肽的修饰对疫苗免疫后的应答水平有较好的增强作用。本研究对MVA‐Ag85B‐TB10.4和MVA‐tPA‐Ag85B‐TB10.4两种结核疫苗的免疫效果进行了考察，初步证实了tPA信号肽对于免疫应答有增强效果。但在tPA信号肽的具体作用机制及疫苗的保护效果等方面，仍需进一步的研究。
【作者】张艳；
【导师】吴永革；
【作者基本信息】吉林大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】结核疫苗；Ag85B；TB10.4；MVA；tPA信号肽；

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